Zapalenie gruczołu mlekowego jest jedną z najkosztowniejszych chorób w sektorze mleczarskim, powodującą znaczne straty ekonomiczne na świecie. Wpływa przede wszystkim na jakość i ilość mleka, a także prowadzi do strat związanych z utylizacją mleka, brakowaniem chorych zwierząt oraz dodatkowymi kosztami leczenia i pracy.

 

Zapalenie gruczołu mlekowego to stan zapalny najczęściej wywołany infekcją wewnątrzgruczołową. Większość przypadków na świecie ma bakteryjne pochodzenie, a sprawcami są takie gatunki jak Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis i Escherlichia coli. Oprócz ekspozycji na patogeny, częstość występowania choroby zależy również od skuteczności mechanizmów obronnych wymienia i czynników środowiskowych.

 

Zapalenia gruczołu mlekowego można podzielić na kliniczne i podkliniczne, w zależności od obecności objawów choroby. Podkliniczne zapalenie występuje dużo częściej niż kliniczne. Jest 15 do 40 razy bardziej powszechne niż forma kliniczna. Kliniczne zapalenie gruczołu mlekowego można łatwo wykryć na podstawie nieprawidłowości występujących w mleku (zmiana konsystencji, zapachu, koloru) oraz wyglądu strzyków i symetrii wymienia. Zależnie od nasilenia, klasyfikuje się je jako łagodne (tylko nieprawidłowości w mleku), umiarkowane (nieprawidłowości w mleku i ćwiartce wymienia) oraz ciężkie (nieprawidłowości w mleku, objawy choroby ogólnoustrojowej z lub bez zmian w ćwiartkach wymienia).

 

W przypadku podklinicznego zapalenia gruczołu mlekowego nie obserwuje się widocznych nieprawidłowości w gruczole czy mleku. Jego wykrycie opiera się na oznaczeniu zwiększonej liczby komórek somatycznych. Ze względu na wyższą częstość występowania niż zapalenie kliniczne i brak widocznych zmian w mleku, wczesne wykrywanie za pomocą skutecznych narzędzi diagnostycznych jest kluczowe dla izolacji chorych krów i zapobiegania rozprzestrzeniania się choroby na zwierzęta zdrowe.

 

Stworzonych zostało wiele testów pod kątem diagnostyki podklinicznego zapalenia gruczołu mlekowego. Poniżej przedstawiono krótki przegląd najczęściej stosowanych metod diagnozowania tej choroby, jak również tych, które są obecnie rozwijane i badane.

 

METODY REFERENCYJNE – WSKAŹNIKI STANU ZAPALNEGO

 

Najczęściej stosowane metody oceny LKS w gospodarstwie to Kalifornijski Test Zapalenia Wymienia (CMT, Terenowy Odczyn Komórkowy – TOK ), Test Wisconsin (WMT) i test aktywności esterazy.

 

Terenowy Odczyn Komórkowy jest najczęściej używanym testem w hodowli bydła mlecznego do pośredniego pomiaru LKS w mleku. Polega na dodaniu odpowiedniego odczynnika do mleka, który wytrąca DNA z komórek, tworząc żel, który można barwić

wskaźnikiem pH. Zmiana lepkości podczas tworzenia się żelu jest mierzona w celu określenia liczby komórek. Test ten jest stosunkowo tani i szybki, ale ma niską czułość i specyficzność. Gdy zapalenia gruczołu mlekowego są spowodowane przez główne patogeny, nadal jest użytecznym narzędziem przesiewowym. Test Wisconsin WMT to modyfikacja CMT opracowana w celu zwiększenia obiektywności pomiaru lepkości. Została również opracowana zmodyfikowana wersja WMT do użytku laboratoryjnego.

 

Liczba komórek somatycznych (LKS, SCC) i różnicowa liczba komórek somatycznych (DSCC): metody laboratoryjne i terenowe

 

Zapalenie gruczołu mlekowego powoduje wzrost liczby komórek somatycznych w mleku (głównie limfocytów, makrofagów i neutrofili PMN) oraz zmianę składu mleka.

Liczba komórek somatycznych jest określana jako liczba komórek somatycznych na mililitr mleka, a jej wartość może wskazywać na toczącą się reakcję zapalną w gruczole mlekowym. W połączeniu z hodowlą bakteryjną, LKS pomaga identyfikować i monitorować infekcje oraz jakość mleka na poziomie ćwiartki, krowy, stada i populacji.

 

Obecnie najpraktyczniejszym i najbardziej zrównoważonym sposobem zarządzania zdrowiem wymienia w stadach krów mlecznych jest monitorowanie wskaźnika indywidualnej liczby komórek somatycznych. Można go mierzyć w laboratorium jako LKS za pomocą mikroskopii bezpośredniej, co wymaga wysokiej jakości mikroskopu i przeszkolonego personelu, lub za pomocą automatycznych elektronicznych liczników komórek, opartych na metodach cytometrii przepływowej, które zapewniają dokładny, szybki i precyzyjny pomiar.

Zazwyczaj, w warunkach terenowych, poziom 200 000 komórek/ml w próbkach zbiorczych (mleko z czterech ćwiartek) jest uznawany za próg do identyfikacji subklinicznego zapalenia wymienia. Jednak zmiany w składzie mleka obserwowano nawet poniżej 100 000 komórek/ml4.

 

Różnicowy licznik komórek somatycznych (DSCC) to nowsze pojęcie definiowane jako łączna proporcja neutrofili PMN i limfocytów w całkowitej liczbie komórek somatycznych. Połączenie DSCC z SCC oferuje nowe podejście do identyfikacji zapalenia wymienia. DSCC zazwyczaj wykonuje się za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej, ale obie metody mają ograniczenia w zastosowaniu poza badaniami naukowymi. Nowo opracowany analizator umożliwia rutynową analizę zarówno DSCC, jak i SCC, wykorzystując nieprzetworzone próbki mleka od poszczególnych krów w sposób ekonomiczny i niezawodny.

 

INNE WSKAŹNIKI ZAPALENIA

Zapalenie wymienia zmienia skład mleka, a niektóre z tych zmian są potencjalnie użyteczne do wykrywania mastitis. Główne zmiany w wymieniu obejmują przeciekanie jonów, białek i enzymów z krwi do mleka z powodu zwiększonej przepuszczalności błon komórkowych, inwazję komórek fagocytarnych w mleku oraz zmniejszenie stężenia niektórych składników mleka. Dotknięta ćwiartka może również produkować substancje związane z reakcją zapalną, takie jak białka ostrej fazy.

Oto niektóre biomarkery i testy:

 

Przewodność elektryczna jest często wykorzystywana jako wskaźnik obecności mastitis, ponieważ test ją określający jest bardzo prosty i szybki. Mastitis zmienia stężenie jonów w mleku, co powoduje wzrost EC powyżej normalnej wartości około 4,6 mS/cm3.

 

Markery biochemiczne

 

Istnieje kilka testów wykrywających subkliniczne mastitis, które obejmują różne substancje metaboliczne, takie jak laktoza, białka i enzymy. Są to markery biochemiczne, które mogą ulegać zmianom podczas subklinicznego mastitis.

  • Laktoza: stężenie laktozy w mleku z mastitis jest niskie z powodu uszkodzenia tkanek.
  • Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest uwalniana do mleka w przypadku uszkodzenia komórek nabłonka gruczołowego lub leukocytów.
  • N-acetylo-ß-D-glukozoaminidaza (NAGase) to enzym lizosomalny uwalniany do mleka z uszkodzonych komórek nabłonkowych gruczołów mlecznych.
  • Białka ostrej fazy, takie jak haptoglobina i amyloid A w mleku, które przedostają się do mleka z krwi z powodu zwiększonej przepuszczalności naczyń włosowatych lub poprzez lokalną produkcję przez leukocyty mleka lub komórki nabłonka gruczołowego.

 

Czujniki ultradźwiękowe i elektromagnetyczne

 

Spektroskopia w podczerwieni średniej (MIR) jest powszechnie stosowana do analizy tłuszczu, białka i laktozy z wysoką dokładnością i powtarzalnością, zarówno w laboratorium, jak i za pomocą przenośnego urządzenia w gospodarstwie, ale nie nadaje się do analizy mleka w systemach online. Spektroskopia bliskiej podczerwieni (NIR) jest mniej dokładna, ale pozwala na użytkowanie online i dostarcza informacji w czasie rzeczywistym. Natomiast spektroskopia w zakresie widzialnym może być używana do wykrywania zmian w zabarwieniu mleka.

 

Biosensory i nanotechnologia

 

Ostatnio coraz częściej wykorzystuje się metody diagnostyczne oparte na nanotechnologii i biosensorach do diagnozowania różnych patogenów powodujących mastitis.

 

Czujniki chemiczne

 

Opracowano pewne projekty eksperymentalne w celu wykrywania niektórych chorób, podczas których powstają charakterystyczne lotne metabolity. Jednym z zastosowań może być wykrywanie mleka od krów z ostrym klinicznym mastitis.

 

 

INNE METODY

Termografia w podczerwieni

 

Termografia w podczerwieni (IRT) to zaawansowana technologia oparta na zasadzie, że wszystkie obiekty emitują promieniowanie podczerwone proporcjonalne do swojej temperatury. Wiele badań wykazało, że termografia jest wystarczająco czułą i nieinwazyjną techniką do badania mastitis. Jednak potrzebne są dalsze badania, aby zbadać pewne czynniki wpływające na tę technikę.

 

Metody oparte na proteomice

 

Opracowywane są metody oparte na proteomice w celu szybkiej, czułej i dokładnej identyfikacji patogenów. Markery białkowe obecne w serwatce krowiej w podklinicznym stadium zapalenia mogą być użyte w diagnostyce proteomicznej. Strategie takie jak MALDI-TOF MS oceniane są jako alternatywne metody do identyfikacji bakterii z próbek mleka zwierząt gospodarskich z większą specyficznością i czułością niż klasyczne metody.

 

DIAGNOSTYKA PATOGENÓW POWODUJĄCYCH ZAPALENIE WYMIENIA

 

Techniki hodowli bakterii

 

Hodowla bakterii z mleka pobranego z dużego zbiornika, pojedynczej ćwiartki lub zbiorczego z całego wymienia, grup lub kategorii krów dodaje dodatkowy wymiar do oceny zdrowia wymienia i programów kontroli zapalenia, szczególnie gdy informacja ta jest łączona z LKS. Jednak techniki hodowli bakterii wymagają znormalizowanych i powtarzalnych metod do ich powszechnego stosowania. Większość patogenów łatwo rośnie na pożywkach agarowych w warunkach tlenowych, ale niektóre mikroorganizmy, takie jak Mycoplasma spp., wymagają specjalnych pożywek. Techniki hodowli mają ograniczoną czułość, która jest dodatkowo ograniczona, ponieważ wymagają izolacji jednej jednostki tworzącej kolonię (CFU) patogenu z 0,01 ml mleka (100 CFU/ml). Zalecenie dotyczące uznania próbki z jednej ćwiartki za pozytywną dla mastitis to użycie 100 CFU/ml, natomiast dla gronkowców niewrażliwych, jak aureus to 200 CFU/ml.

 

Techniki oparte na PCR

 

Wysoka specyficzność i czułość PCR sprawiły, że metoda ta jest odpowiednia do diagnozy zapalenia wymienia. Istnieje wiele testów stosowanych do wczesnego wykrywania zapalenia, zarówno w warunkach terenowych, jak i w laboratorium, w celu identyfikacji trudnych do izolacji patogenów zakaźnych, takich jak Mycoplasma spp. Niektóre dostępne zestawy ilościowo określają DNA bakterii z 100% czułością i 99-100% specyficznością. Jednak metody PCR mogą również dawać wyniki fałszywie dodatnie i nie rozróżniają bakterii żywych od nieżywych. Dlatego wyniki PCR powinny być używane w połączeniu z innymi informacjami, takimi jak historia zapalenia wymienia, inspekcja wymienia i LKS.

mastatest

BIBLIOGRAFIA

  1. Huijps, Kirsten & Lam, T.J.G.M. & Hogeveen, Henk. Costs of mastitis: Facts and perception. Journal of Dairy Science 75 (2008).
  2. Kour, Savleen & Sharma, Neelesh & Natesan, Balaji & Kumar, Pavan & Soodan, Jasvinder & Santos, Marcos & Son, Young-Ok. Advances in Diagnostic Approaches and Therapeutic Management in Bovine Mastitis. Veterinary Sciences. 2023.
  3. Narváez-Semanate, José & Daza Bolaños, Carmen Alicia & Valencia-Hoyos,Carlos & Hurtado-Garzón, Diego & Acosta-Jurado, Diana. Diagnostic methods of subclinical mastitis in bovine milk: an overview. Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín. 2022; 75. 10077-10088.
  4. Bulletin of the International Dairy Federation 466/2013
  5. Zecconi A, Dell’Orco F, Vairani D, Rizzi N, Cipolla M, Zanini L. Differential Somatic Cell Count as a Marker for Changes of Milk Composition in Cows with Very Low Somatic Cell Count. Animals (Basel). 2020 Apr 1;10(4):604.
  6. Adkins PRF, Middleton JR. Methods for Diagnosing Mastitis. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2018 Nov;34(3):479-491.
  7. Pyörälä, Satu. Indicators of inflammation in the diagnosis of mastitis. Veterinary research. 34. 2023; 565-78.
  8. Brandt, M & Haeussermann, Angelika & Hartung, Eberhard. Invited review: Technical solutions for analysis of milk constituents and abnormal milk. Journal of dairy science. 2010; 93. 427-36.
  9. Chakraborty S, Dhama K, Tiwari R, Iqbal Yatoo M, Khurana SK, Khandia R, Munjal A, Munuswamy P, Kumar MA, Singh M, Singh R, Gupta VK, Chaicumpa W. Technological interventions and advances in the diagnosis of intramammary infections in animals with emphasis on bovine population-a review. Vet Q. 2019 Dec;39(1):76-94.
  10. Polat B, Colak A, Cengiz M, Yanmaz LE, Oral H, Bastan A, Kaya S, Hayirli A. Sensitivity and specificity of infrared thermography in detection of subclinical mastitis in dairy cows. J Dairy Sci. 2010 Aug;93(8):3525-32.