La mastite è una delle malattie più costose nell’allevamento della vacca da latte, che causa notevoli perdite economiche nell’industria lattiero-casearia globale, principalmente perché influisce sulla qualità e quantità del latte prodotto. Il suo impatto economico è dovuto principalmente allo scarto del latte e all’eliminazione degli animali colpiti ma anche ai costi dei trattamenti terapeutici e ai costi aggiuntivi di manodopera1.
Oltre che dall’esposizione ai batteri patogeni, l’incidenza della malattia dipende anche dall’efficacia dei meccanismi di difesa della mammella e dalla presenza di fattori di rischio ambientali.
L’infiammazione della ghiandola mammaria (IMI), a seconda della presenza o meno di segni clinici, può essere clinica o subclinica. La mastite subclinica spesso passa inosservata perché non dà luogo a sintomi evidenti, ma la sua incidenza può essere significativamente più alta rispetto alla forma clinica. Gli studi indicano che la mastite subclinica può essere da 15 a 40 volte più frequente rispetto alla mastite clinica2.
Considerate le caratteristiche delle mastiti subcliniche (la maggiore prevalenza rispetto alle forme cliniche, la possibilità di precedere una forma clinica, la più lunga durata dell’infezione, la mancanza di alterazioni visibili nel latte e a carico della mammella, l’impatto negativo sulla quantità e qualità del latte, l’essere una potenziale fonte di contagio per gli altri animali all’interno della mandria), una diagnosi precoce mediante l’uso di efficaci strumenti diagnostici è fondamentale per il trattamento delle vacche colpite e per l’eventuale isolamento atto a prevenire la diffusione della malattia alle vacche sane. Questo articolo offre un’ampia panoramica dei metodi più comunemente utilizzati per la diagnosi di mastite, nonché di quelli attualmente oggetto di studio ed in fase di sviluppo.
METODI DI RIFERIMENTO – INDICATORI DI INFIAMMAZIONE
Conta delle cellule somatiche (SCC) e conta differenziale delle cellule somatiche (DSCC): metodi di laboratorio e on-farms
La mastite porta a un aumento delle cellule somatiche del latte [principalmente linfociti, macrofagi e neutrofili polimorfonucleati (PMN)] e ad alterazioni della composizione del latte. La conta delle cellule somatiche (SCC) è il numero di cellule somatiche per millilitro di latte, in risposta all’infiammazione della ghiandola mammaria. In associazione alla coltura batterica, la Conta delle Cellule Somatiche (SCC) aiuta a identificare e monitorare le infezioni mammarie e la qualità del latte a livello di quarto, vacca, mandria e popolazione. Attualmente, il modo più pratico e sostenibile per gestire la salute della mammella nelle mandrie da latte è il monitoraggio delle singole conte cellulari. La SCC può essere misurata in laboratorio attraverso la microscopia diretta, che richiede un microscopio di alta qualità e la formazione del personale, oppure utilizzando contatori elettronici automatizzati (cell counters), basati sulla citofluorimetria (una tecnica che utilizza un fascio di luce laser per rilevare la fluorescenza delle cellule in sospensione e che converte questi segnali in dati digitali), che forniscono misurazioni accurate, rapide e precise.
Di solito, in condizioni di campo, un livello di 200.000 cell/mL su campioni compositi (latte da tutti e quattro i quarti) è considerato il valore soglia per identificare la mastite subclinica. Tuttavia, è possibile osservare modifiche nella composizione del latte anche al di sotto di 100.000 cellule/mL4.
La Conta Differenziale delle Cellule Somatiche (DSCC) di sviluppo più recente, è la proporzione combinata di PMN e linfociti all’interno della SCC totale. La combinazione della DSCC con la SCC offre un nuovo approccio per identificare la mastite. Un analizzatore di nuova concezione consente l’analisi di routine sia di DSCC che di SCC in modo conveniente e affidabile utilizzando campioni di latte vaccino non trattato5.
I metodi più comuni per stimare la SCC individuale sono il California Mastitis Test (CMT), il Wisconsin Mastitis Test (WMT).
- Il California Mastitis Test (CMT) è il test di campo più ampiamente utilizzato per la misurazione indiretta della SCC nel latte. Consiste nell’aggiunta di un detergente al latte che precipita il DNA dalle cellule creando un gel, che può essere colorato utilizzando un indicatore di pH. La variazione di viscosità sulla formazione del gel viene misurata per fornire un’indicazione del conteggio delle cellule. È relativamente poco costoso e rapido ma ha bassa sensibilità e specificità. Quando le IMI sono causate da patogeni principali, è comunque uno strumento di screening utile6.
- Il Wisconsin Mastitis Test (WMT) è una modifica del CMT sviluppata per aumentare l’oggettività della misurazione della viscosità. Si tratta di un test di laboratorio generalmente condotto su campioni di latte di massa. I punteggi possono essere utilizzati per prevedere il numero medio di cellule somatiche.
Questo metodo indiretto utilizza lo stesso reagente del CMT; tuttavia, la reazione non viene stimata ma misurata dall’altezza del gel (in mm) in una provetta, fornendo un risultato più preciso del CMT. Una modifica del WMT è stata adattata per l’uso on-farm; può essere eseguita in pochi minuti e si traduce in una misurazione semiquantitativa della SCC; tuttavia, il test richiede un campione refrigerato raccolto entro 5 ore dal test. Il WMT è solitamente utilizzato come test di screening sul latte per la sua semplicità e obiettività.
ALTRI INDICATORI DI INFIAMMAZIONE
Alcune variazioni nella composizione del latte sono potenzialmente utili per rilevare la mastite subclinica. Le principali alterazioni nella mammella includono il passaggio di ioni, proteine ed enzimi dal sangue al latte a causa di una maggiore permeabilità, l’invasione di cellule fagocitiche nel comparto mammario e una ridotta concentrazione di alcuni costituenti del latte. Il quarto interessato può anche produrre sostanze correlate alla reazione infiammatoria, come le proteine di fase acuta7. Di seguito sono elencati alcuni dei test e biomarcatori:
Test Conducibilità elettrica (CE)
È l’indicatore più comunemente utilizzato per il monitoraggio della salute della mammella, poiché è molto semplice e rapido. La mastite altera la concentrazione di ioni Na+, Cl– e K+ nel latte: la concentrazione di K+ diminuisce mentre le concentrazioni di Na+ e Cl– aumentano a causa dei cambiamenti di permeabilità delle cellule e dei vasi sanguigni causando un aumento della CE al di sopra del suo valore normale8. In una vacca non infetta il valore di CE varia da 4 a 5.5 hS/cm (microsiemens per cm).
Marcatori biochimici
In laboratorio sono disponibili diversi test per rilevare la mastite subclinica che includono varie sostanze metaboliche come lattosio, proteine ed enzimi, come NAGase e l-lattato deidrogenasi (LDH). Un cambiamento nella loro concentrazione nel latte avviene in risposta a un’infiammazione della mammella come risultato della risposta immunitaria dell’animale contro l’infezione ed è causato in misura limitata da altri effetti. Questi marcatori biochimici possono essere misurati tramite analisi colorimetriche e fluorimetriche e possono aiutare a diagnosticare la mastite subclinica in una fase molto precoce6.
- Lattosio: la concentrazione di lattosio nel latte mastitico diminuisce a causa del danno tissutale.
- Lattato deidrogenasi (LDH) viene rilasciata nel latte quando si verifica un danno cellulare alle cellule epiteliali mammarie o ai leucociti.
- NAGasi è un enzima lisosomiale che viene rilasciato nel latte dalle cellule epiteliali mammarie danneggiate e, in misura minore, dalle cellule somatiche del latte in risposta a un’infezione mammaria. Il Test di attività esterasica, che misura l’attività della NAGase, è un test qualitativo che converte i risultati di una reazione enzimatica in una stima della SCC. Richiede dai 5 ai 45 minuti di incubazione, a seconda del tipo, ed è considerato un buon indicatore della presenza di mastite subclinica nei bovini da latte, soprattutto se utilizzato in combinazione con altri test come il CMT e la SCC1
- Proteine di fase acuta, come l’Aptoglobina e l’Amiloide A del latte, che migrano dal sangue al latte a causa dell’aumentata permeabilità capillare o aumentano attraverso la produzione locale da parte dei leucociti del latte o delle cellule epiteliali mammarie. Queste proteine di fase acuta variano in base all’agente causale e al tipo di mastite.
Biosensori e nanotecnologia
Di recente, la nanotecnologia e i metodi diagnostici basati sui biosensori sono stati sempre più utilizzati nella diagnosi di mastite2,9.
Questi sistemi diagnostici aiutano a rilevare la mastite solitamente con uno stress minimo per l’animale e sono particolarmente utili nelle grandi aziende agricole ben organizzate. L’identificazione dei casi di mastite da un numero elevato di animali richiede adeguate tecnologie di rilevamento automatico, come la tecnica del monitoraggio della conta individuale delle cellule somatiche (ISCC) insieme alla conducibilità elettrica (EC) del latte basata sui quarti, in modo che i casi di mastite clinica possano essere riconosciuti in tempo utile.
Il test del biosensore colorimetrico basato su nanoparticelle magnetiche è stato sviluppato utilizzando la plasmina come biomarcatore perché, nei casi di mastite, la plasmina aumenta la proteolisi della caseina e riduce la qualità del latte. Questo test può distinguere tra il latte di animali sani e quello di bovine con mastite.
ALTRI METODI
Termografia a infrarossi
Anche le nuove tecniche diagnostiche, come l’IRT, hanno trovato applicazioni nella diagnosi della mastite.
Tutti gli oggetti emettono radiazioni infrarosse in relazione alla loro temperatura. La termografia a infrarossi (IRT) è una tecnologia sofisticata, sufficientemente sensibile e non invasiva, che rileva i cambiamenti termici sulla cute della mammella causati dalla mastite subclinica. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per indagare su determinati fattori che possono influenzare questa tecnica10.
Nel rilevamento della mastite subclinica, la sensibilità diagnostica e la specificità dell’IRT sono state rispettivamente del 95,6% e del 93,6%, rispetto all’88,9 e al 98,9% del CMT. La termocamera altamente sensibile può rilevare temperature più elevate nei casi clinici e più basse in quelli subclinici nei bovini. In una prospettiva futura, l’IRT potrebbe diventare una procedura per la diagnosi precoce della mastite sul campo e, con l’applicazione basata su dispositivi mobili, uno strumento diagnostico semplice, portatile e comodo.
Metodi basati sulla proteomica
La proteomica è lo studio delle proteine presenti in una cellula e si occupa di capire come funzionano e come interagiscono tra loro.
Studi basati sulla proteomica hanno rivelato che le proteine del siero ottenute da vacche sane sono diverse da quelle con mastite subclinica. Perciò, i marcatori proteici presenti nel siero di latte bovino durante la fase subclinica della mastite potrebbero essere utilizzati nella diagnosi basata sulla proteomica9.
Nello sviluppo di metodi basati sulla proteomica, per un’identificazione rapida, sensibile e accurata dei patogeni, sono state studiate in modo approfondito e identificate circa 80 proteine in relazione alla risposta dell’ospite alle infezioni mammarie e molte altre sono in fase di studio.
La spettrometria di massa MALDI-TOF è considerata una delle tecniche più potenti negli studi di proteomica ed è un metodo alternativo per l’identificazione su larga scala di batteri da campioni di latte con maggiore specificità e sensibilità rispetto al metodo microbiologico convenzionale.
TEST SPECIFICI PER LA DIAGNOSI DEI PATOGENI CHE CAUSANO LA MASTITE
Esami colturali
L’esame colturale del latte di massa, o di singolo quarto o dal ‘pool’ dei quarti, da gruppi o da categorie di vacche aggiunge un’ulteriore dimensione alla valutazione della salute della mammella e dei programmi di controllo della mastite, soprattutto quando tali informazioni vengono combinate con la SCC.
La maggior parte dei patogeni cresce facilmente su agar in condizioni aerobiche; tuttavia, nel 10-40% dei campioni di latte mastitico di quarto, non si osserva alcuna crescita all’esame batteriologico. Le cause di tale situazione possono essere diverse, vale a dire presenza di una bassissima carica batterica, o presenza di antibiotici nel latte, che possono inibire la crescita microbica, o infezioni latenti o cicli di escrezione in caso di mastite subclinica. Inoltre, i campioni possono contenere microrganismi, come Mycoplasma spp., che richiedono tecniche e terreni speciali per la coltura.
Il tasso di isolamento dei patogeni può aumentare utilizzando terreni di coltura specifici, incubazione, congelamento o aumentando il volume di inoculo.
Maldi-Tof
Tra i metodi diagnostici più recenti e innovativi per la mastite vi è la MS MALDI-TOF, basata sul principio della spettroscopia di massa, che può essere utilizzata per la determinazione delle specie di batteri e dei ceppi o delle loro proteine in tempi molto brevi (entro pochi minuti). L’affidabilità della tecnica è elevata, può essere utilizzata facilmente ed è specifica e sensibile al 100%. È importante notare che la tecnologia non è ancora così economica per l’uso su vasta scala.
Tecniche basate sulla PCR
L’elevata specificità e sensibilità della PCR l’hanno resa molto appropriata per la diagnosi di mastite sia su campioni individuali che su campioni di latte di massa, sia per la mastite subclinica che per quella clinica.
Esistono vari test, utilizzati sia in condizioni di campo che in laboratorio, o per identificare patogeni infettivi difficili da isolare, come i Micoplasmi. Alcuni kit disponibili quantificano il DNA dei batteri con una sensibilità del 100% e una specificità del 99-100%. Tuttavia, la PCR convenzionale fornisce una semplice identificazione del microrganismo basata sull’amplificazione del materiale genetico o del DNA può dare anche dei falsi positivi e non distinguere tra batteri vitali e non vitali. Pertanto, i risultati della PCR dovrebbero essere utilizzati in combinazione con altre informazioni come la storia della mastite, l’ispezione clinica della mammella e la SCC2.
Per consentire la quantificazione del DNA dei batteri in relazione alla mastite, sono stati sviluppati vari test di trascrizione inversa (RT)-PCR. Per rilevare più patogeni contemporaneamente nei campioni di latte mastitico, è nata la PCR multiplex (m-PCR), un test rapido ed economico. La m-PCR con una singola reazione può rilevare nove batteri importanti, come S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. epidermidis, S. aureus, S. haemolyticus, S. chromogenes, E. coli e Mycobacterium bovis. Rispetto ai tradizionali metodi di coltura batterica di laboratorio, questo test è sensibile all’88% e specifico al 98%.
PER CONCLUDERE
I metodi di rilevamento sono fondamentali nella diagnosi della mastite, soprattutto quando si tratta di mastite subclinica, data la sua rilevanza sanitaria ed economica. I metodi convenzionali, come la conta delle cellule somatiche, il CMT e il WMT, sono ampiamente utilizzati in tutto il mondo per la loro praticità e facilità d’uso. Tuttavia, il continuo miglioramento delle tecniche diagnostiche ha portato allo sviluppo di metodi alternativi che stanno guadagnando sempre più attenzione grazie alla loro sensibilità, specificità, rapidità e accuratezza.
I progressi tecnologici e le crescenti conoscenze in proteomica e genomica stanno determinando un significativo passaggio verso nuovi approcci nella diagnosi della mastite. Tra questi, la diagnosi molecolare, i biomarcatori diagnostici, il sequenziamento nucleotidico, l’analisi spettrometrica di massa e i test immunologici specifici sono metodi altamente sofisticati, rapidi e affidabili. Questi approcci consentono una diagnosi molto precoce della mastite e l’implementazione di misure preventive per ridurre al minimo le perdite economiche.
Per approfondire il tema
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